酶标仪性能评价与鉴定方法

近几年来，酶标仪在临床实验室中的应用日益普及，使酶免疫分析法得到广泛应用。（EIA）自动化程度和精度越来越高，尤其是近年来，进口、国产单通道、多通道全自动酶标仪的种类和型号发展非常迅速，是继生化分析仪、血细胞计数仪、血凝仪等之后临床实验室自动化程度的又一次更新和提高。但国内外对酶标仪性能系统的评价方法很少，有的评价指标简单不***，有的对其性能评价方法不一致，导致不同仪器、厂家、用户、用户的评价指标缺乏可比性。这是因为酶标仪在制造过程中(多通道检测器)、测定原理(垂直光路光度测定法)与其他水平光路光度测定仪器(721分光光度计)有很大不同。因此，经过系统的研究和论证，我们初步建立了一套相对完善的酶标仪性能评价指标和鉴定方法，对国内外几家不同厂家和型号的仪器进行了系统的研究和论证。经过初步应用，效果令人满意。根据读者和用户的要求，拟介绍和补充酶标仪性能评价和鉴定方法的理论及其原理，供同行在评价、鉴定和使用仪器时参考，从而为进一步提高检测结果的室内重复性和室间可比性提供可靠的保障。

方法和原理

滤光片波长精度检查及其峰值测定

1.1.方法及其衡量标准：采用高精度紫外可见分光光度计(波长精度)±0.3nm）光谱扫描不同波长的滤光片。检测值和校准值的区别是滤光片的波长精度。差值越接近零，峰值越大，滤光片质量越好，波长精度越高。

1.1.2理论基础:酶标仪滤光片的质量直接影响仪器的灵敏度，滤光片的质量是根据其波长精度及其峰值指标来衡量的。因此，滤光片的波长精度和峰值是衡量酶标仪的重要参数之一。虽然这在制造商的仪器手册中没有提到，但在仪器的实际使用过程中，我们发现检查滤光片的波长精度和峰值是非常重要和必要的。通过检查，我们可以发现滤光片的波长标定值与实际测量值的一致性。

1.2监测灵敏度和准确度

1.2.1方法：①敏感性：***配制6ug/ml重铬酸钾(干燥)溶液(0.05mo1／L硫酸溶解)，在小孔杯中加入200ul重铬酸钾溶液，0.05mo1／在450nm(参考波长650nm)测定中，L硫酸溶液的吸光度应该是空白的，≥0.01A。②***度：***配制：1mmo/L对硝基苯酚(提纯)水溶液，然后10mmo1／25倍稀释L氢氧化钠溶液，在小孔杯中加入200ul稀释液，10mmo1／在405nm(参考波长650nm)检测中，LNaOH溶液的吸光度应为0.4nm。A（0.395～大约0.408A)。

1.2.2说明:仪器的灵敏度和精度主要受两个因素影响:一是滤光片波长的精度，二是检测器的质量。通常，仪器的灵敏度和精度因滤光片的原因而降低，容易检查；然而，检测器的质量差异不容易被发现。因此，我们使用上述两种标准物质溶液定期监测仪器检测器的质量，从而保证仪器检测结果的可靠性。对于仪器精度的测定，我们采用了文献报道的方法，在同一型号的仪器之间反复测定了多次。结果表明，标准物质溶液在450nm的长度和长度之间中有待测定。

1.3通道差和孔间差检测

1.3.一种方法及其表达方式：①通道差检测:取一个酶标板小孔杯(杯底必须光滑、透明、无划痕、无污染)，以酶标板框架为载体，在8个通道的相应位置加入三种不同浓度的甲基橙溶液200ul，蒸馏水调零，采用双波长连续测量三次(测定波长490nm，参考波长630或650nm，以下均相同)，观察其不同通道之间测量结果的一致性。②孔间差测量：选择同一厂家，同一批号酶标板条(共96孔8条)，分别加入200ul甲基橙溶液(吸光度调至0.065)～0.070A)先后放置在同一通道，蒸馏水调零，采用双波长检测，误差大小采用±1.96s衡量。

1.3.2理论解释:为了提高酶标仪的检测速度，根据96孔酶标板的规格特点，目前大部分厂家的中***酶标仪都采用8通道检测器(部分中低档酶标仪仍采用单通道)。．因此，每个通道的检测能力是不同的。它是仪器内部的固有误差，与测量的溶液浓度成正相关(不同的探测器对不同浓度的溶液有不同的反应能力)，因此通道差是衡量酶标仪性能好不好的重要指标之一；其衡量指标表示极差，与厂家推荐的指标一致；极差值越接近零，通道差越小，说明同一产品在不同通道的检测结果中的一致性越好。

由于不同厂家和批号酶标板的质量差异，孔与孔之间的检测结果并不完全一致，这与水平光路光度计的比色皿质量是否符合要求相同。因此，我们认为孔之间的差异是仪器外部的固有误差。只有准确测量孔之间的差异，并对结果进行相应的校正，检测结果才能更加实际，更加准确可靠。评价指标(士1.96s)也有利于结果校正。此外，在设计孔之间差测量的操作方法中，我们将200ul甲基橙溶液的吸光度调整到0.0655～0.070A，充分考虑加样器的误差(上海求精公司，200ul，士2％CV），其目的是将加样误差控制在仪器的分辨率(0.01A)以下，从而避免了孔间差结果不会因加样误差而导致假性增加。

1.4零点飘移

1.4.方法1:取八个小孔杯，分别放置在八个通道的相应位置，加入200ul蒸馏水，调整为零，每30分钟测量一次双波长或单波长(490nm)，观察8个通道4小时内吸光度的变化。它与零点的区别是零点漂移。

1.4.2测量原理:酶标仪的零点漂移通常很小，这是因为在阅读仪器数量之前，需要测量8个通道的底部。（Io）．接着读取样品板的每个孔的测定值（I），按照Beer'slaw光吸收值=1ogl0（Io／I），每次读数都经过这样的自动校正，大大减少了读数的误差。这种阅读方法无疑是非常正确的；此外，一些仪器被用作“DRLDYE“检测条用于校准***吸光度，因此在采用单波长测量时，吸光度的假性会增加。这种仪器可以通过两种方法进行校正。一种是选择合适的参考滤光片进行双波长测量，另一种是引入校正参数，即在吸光模式下单波长读取一个空白孔，其测试值和预测值之间的差异就是校正参数。因此，零点漂移是评估仪器在一定时间内零点吸光度的变化趋势，与波长无关。它间接反映了仪器内部检测系统在单位时间内工作的稳定性和仪器的机械性能(连续进板、检测、退出)，因此是评估仪器内部电路系统、光学系统(检测器)和机械系统是否良好的指标。

1.5***度评价

1.5.方法和评价指标:每个通道加入3个小杯，分别加入200ul高、中、低三种不同浓度的甲基橙溶液，蒸馏水调零，双波长平行测量，每天测量两次，连续测量20天。分别计算其批次精度、日内批次精度、日间精度和总精度以及相应的CV值。

1.5.2理论依据:1984年，美国临床实验室标准委员会发布了EP5一T文件，并于1992年进行了第二次修订:用户对临床化学仪器精度性能的评价。该评估方案广泛应用于生化分析仪、血细胞计数仪等仪器和试剂的评估，统一了评估仪器的方法。然而，国内外尚未报道该方法用于酶标仪的评估。我们用这种方法系统地评估酶标仪，结果相当令人满意。每个指标的意义是:批准内的精度系统由20d每天两批，每批两次的差异(即“批准内”)经统计处理后得到的结果；日内批准间的精度系统由20d每天两批测量结果之间的平均差异(即“批准间”)经统计处理后得到的结果；日间精度是指20d每天测量平均值的标准差，即标准错误，反映了每天平均值的离散度；总精度是加权统计批准内、批准间和日间精度的结果。其中，批准精度和总精度的应用***为广泛。与传统的批准精度计算方法(即同一标本在同***重复测量多次)相比，前者更符合实验室的实际情况，更具代表性和合理性；总精度客观***地反映了实验室的整体变异。

1.6线性测定

1.6.方法1:准确称为甲基橙，配制5系列浓度溶液，用双波长平行测试8次，以求其平均值。计算回归方程、相关系数r和标准估计误差Sy，x，并用±1.96Sy，x表示样品的95％测量范围。

1.6.2评价指标说明:线性测量也是评价仪器的重要手段之一，因为它是仪器定量工作的基础和前提。一些制造商用标准估计误差s来衡量线性，这与实验室通常使用的相关系数R是一致的。因此，在进行线性评估时，我们同时报告R和Sy。x，旨在提高用户和制造商之间的可比性。

1.7双波长评价

1.7.方法1:使用酶标仪检测样品时，由于溶液中的小气泡、杯底的水印和划痕、小孔杯透明度的差异等。，这些都是仪器测量过程中***常见的干扰因素，而标本中的干扰成分(如溶血、黄道)由于洗涤对测量结果的影响较小。因此，我们将文献中的双被长评价方法改为:取相同工厂、相同批号的酶标板条(每条通道共24孔)。～单波长(490nm)和双波长(测定波长490nm)分别用于8个通道(测定波长490nm)、参比波长630／650nm)进行测试，计算单波长和双波长测定结果的平均值和离散度，比较各组之间是否存在统计差异，以检查双波长清除干扰因素的效果。

1.7.2说明:在双波长测量过程中，由于标本中干扰组分的存在和小孔杯本身的质量，测量结果的假性往往会增加，而酶标仪提供的双波长测量功能可以消除干扰组分或因素对测量结果的影响。．对于去除标本中的干扰组分，在选择参考波长时，应研究干扰组分的光谱，以正确选择参考波长；但是，只要选择远离测定波长的参考波长，就可以消除小孔杯本身的质量问题等干扰因素，这对于保证测定结果的准确性非常重要。

2.小结

目前国内外关于酶标仪性能评价和鉴定方法的报道并不多见。由于酶标仪在临床实验室的应用越来越普及，建立完善的酶标仪性能评价方法，对仪器进行***系统的综合评价，是临床实验室工作人员的当务之急，这对于进一步增强仪器之间的可比性，保证ELA方法的工作质量至关重要。同时，将其评价指标引入检测结果的校正工作中，合理制定各定性试验项目的可信度限制和界值，对正确的评价结果进行定量检测。

2.2在评估酶标仪时，还应对仪器的自动化程度和售后服务有一个***的了解。自动化程度，如仪器的分辨率(通常为0.001A)、报告方式(通常提供4条～超过6种格式)、滤光片的***数量(有的厂家可以根据用户要求定制)、是否为用户提供自编程程序和外部微机的功能和软件等。

2.3售后服务也是仪器使用顺利与否的根本保证。用户应与信誉好、服务周到、维护方便的代理商进行交谈，避免仪器一旦出现故障，不会影响工作或使仪器瘫痪，无法发挥应有的社会效益和经济效益。

2.4还需要强调的是，由于酶标仪的种类和型号很多，每种仪器的测量原理也不同。为了保证不同仪器之间测量结果的一致性，我们认为在测量时应该采用双波长法，并且必须采用双波长法，这样不仅可以消除干扰组分和干扰因素的影响，还可以避免仪器结果因测量原理不同而产生的不一致性。