一篇讲透酶标仪的文章

你相信“光”！

光是电磁波，波长100nm-400nm称为紫外线，人眼可以观察到400nm-780nm之间的光，780nm以上称为红外线。人们只能看到颜色，因为光照射在物体上，被物体反射回来。绿色植物是绿色的，因为它们吸收了光中的红光谱。酶标仪测定的原理是在特定波长下检测被测物体的吸光值。

“光”和酶标仪

酶标仪，即酶联免疫检测仪，用于检测ELISA反应后的吸光值，主要由光路系统和信号采集系统组成。工作原理如下：

光源灯发出的光波通过滤光片或单色器变成单色光，一部分被标本吸收，另一部分通过标本照射到光电探测器上；

光电检测器将光信号转换为相应的电信号，经过一系列信号处理后送到微处理器进行数据处理和计算，***终显示结果。

酶标仪分类

按照滤光方式进行分类

分为滤光片式酶标仪(固定波长酶标仪)、光栅酶标仪(全波长酶标仪)，属于光吸收酶标仪；

滤光片是光学玻璃镀光学膜层，使滤光片改变通过的波长，分离不必要的波长光。根据选定的滤光片，只能截取特定的波长进行测试。

光栅类型是利用物理衍射光栅原理从不同角度分离白光光源，然后通过一系列狭缝分离选定的刺激波长。光栅酶标仪可以在光源波长范围内截取

目前，滤光片系统具有价格便宜、检测灵敏度高、带宽选择性强、滤光片切换快等优点，应用广泛。

讨论光栅与滤光片的区别比较

a、酶标仪光的纯度差比较

光电检测***使用高纯度的光，但无论使用哪种分光器，都不可能获得***纯度的光。

光栅：就光栅分光而言，光是纯的，但由于透光孔有一定的宽度，比色盘接受的光是指定波长附近波段上的等强光。

滤光片：滤光片分光后，通过透光孔接受的光也是一个波段，但指定波长上光的强度***，呈正态分布。

b、酶标仪光的稳定性差比较

光栅：由于不可避免的机械误差和2-3次反射后的小角度偏差，棱镜或光栅片的绕轴旋转会造成很大的偏差和波长不稳定。此外，光栅是一个狭窄的接缝，其能量也会非常弱。为了获得大的电压值，小的检测电压信号必须大倍数放大，这样误差也会放大，导致检测不稳定

滤光片：由于同一滤光片上每点的光波长相同，每个位置通过光偶准确定位，不受仪器本身机械误差的影响，光强聚集，能量高，电压信号相对强，主流光强，其他杂光影响弱，可忽略，误差小，光稳定，检测相对稳定。

c、酶标仪设备后期维护的差异

光栅：一旦螺钉松动，传动误差，更换灯泡，导致中心波长偏移，一般难以调整到合适的位置，必须由专业厂家使用专业设备调试，事实上，大多数国内用户没有得到这方面的培训和通知，所以基本上一年后，偏差不会去厂家校准。

滤光片：结构简单，维护方便。只需稍加培训即可完成维护。

d、酶标仪器检测灵敏度的差异

滤光片透光率很好（可高于85%），即光能损失较小。在荧光检测中，通过滤光片进入样品的刺激光和通过滤光片进入检测器的发射光只有少量损失（约10%）。光损失少，光能自然大，荧光信号自然易于检测。这是为了获得高信噪比（SNR）***初的保证。因此，由于信噪比高，（SNR）确保滤光片系统自酶标仪诞生以来一直是高灵敏度检测的黄金标准。不难发现，许多具有光栅酶标仪的制造商在一些高端应用程序中具有较高的检测灵敏度要求（如：TRF、TR-FRET、等)，将有另一个滤光片模块的设计。由于这些高端应用程序，光栅系统没有令人满意的效果或根本做不到。

光栅系统带来了方便，但也有一些缺点。基于光路设计的问题，光栅的光能损失远远大于滤芯。在荧光检测中，光源通过光栅产生的刺激光比原来的能量少。激发样品后，发射光释放，发射光通过光栅分隔所需的波长。分离后的发射光能量再次流失。光栅酶标仪的灵敏度不如滤光片酶标仪，因此高端光栅酶标仪还应配备滤光片模块进行TRF、TR-检测FRET等高灵敏度要求。

按功能分类

可分为单功能酶标仪（分为光吸收、荧光、化学发光等）和多功能酶标仪。多功能酶标仪是上述两个或两个以上检测模块的集成，通常至少可以提供光吸收和荧光，一些高端多功能酶标仪还可以支持化学发光、时间分辨荧光、荧光偏振、生物发光共振能量转移，甚至支持“Western Blot和“上转换发光”等检测。

用什么样的“光”来检测和测量

测量波长的原理

光通过被检测对象，前后的能量差异是被检测对象吸收的能量。在特定波长下，同一被检测对象的浓度与被吸收的能量成定量关系。

检测单位用OD值表示，OD是opticaldelnsity(光密度)缩写表示被检测物体吸收的光密度，OD=10g（1/trans），其中，trans是检测物的透光值。根据bougerrer-amberT-在beer法则中，OD值与光强度有以下关系：

E=OD=logⅠ0/ⅠE表示被吸收的光密度，Ⅰ0为检测对象前的光强度，Ⅰ从被检测物体中产生的光强。

OD值由以下公式计算：

E=OD=C×D×E

其中：C是检测物的浓度；D是检测物的厚度；E是摩尔因子。

在特定的波长下测量每种物质都有特定的波长，这种物质可以吸收***多的光能。如果选择其他波长段，则会导致检测结果不准确。因此，在测量测试对象时，我们选择特定的波长进行测试，称为测量波长。

然而，每种物质对光能仍有一定的非特异性吸收。为了消除这种非特异性吸收，我们选择另一个参考波长来消除这种不准确性。在参考波长下，物体光的吸收***小。检测波长与参考波长之间的吸光值差可以消除非特异性吸收。

常用波长

一般酶标仪的测定波长为400～在750nm或800nm之间，完全可以满足ELISA的显色测定。

目前国内常用的ELISA试剂盒使用的标记酶均为辣根过氧化物酶(HRP)，四甲基联苯胺通常是四甲基(TMB)和邻苯二胺(OPD)，在过氧化氢溶液的存在下，在HRP的作用下，分别氧化成二氨基偶氮苯(DAB)和联苯醌。

当pH值在5.0左右时，DAB在450nm波长处吸收***；

当pH值降至4.0时，***吸收波长移至492 nm，同时，摩尔的消光系数变大，颜色变深，因此硫酸或盐酸等强酸常用于终止反应。

TMB氧化物联苯醌在波长450nm的情况下具有***的消光系数，如果HRP量少，H：O：当TMB过量时，就会形成蓝色的阳离子根。

降低pH值，可将蓝色阳离子根转化为黄色联苯醌，硫酸作为终止剂可使产品稳定90min。

目前ELISA***常用的波长是450nm和492nm，考虑到双波长比色的需要，还应该有630nm和405nm波长的滤光片。